Gepubliceerd in:
2016 | OriginalPaper | Hoofdstuk
1. Waarnemingsmethoden
Auteurs : Anthony L. Mescher, prof.em.dr. E. Wisse, dr. C.P.H. Vreuls, prof.dr. J.-L. Hillebrands
Gepubliceerd in: Functionele histologie
Uitgeverij: Bohn Stafleu van Loghum
Samenvatting
Prepareren van cellen en weefsels voor microscopie
-
Fixeren dient om het metabolisme te stoppen, de structuur vast te leggen en het weefsel klaar te maken voor verdere bewerking, zoals coupes maken en kleuren.
-
Chemische fixatie denatureert eiwitten onder andere door ‘crosslinking’ waarbij enzymen onwerkzaam worden, maar autolyse' voorkomen wordt.
-
Chemisch fixeren gebeurt door het toepassen van formaldehyde, glutaaraldehyde of osmiumtetroxide, al dan niet na elkaar of in combinatie.
-
Fysisch fixeren kan door bevriezen.
-
Na dehydratie in een alcoholreeks met opklimmende sterkte en impregnatie met paraffine of monomeer plastic worden kleine weefselstukjes en cellen ingebed.
-
Paraffinecoupes worden op een microtoom gesneden tot coupes van 5 μm voor Lm. Ultradunnecoupes van 50 nm voor Tem worden gesneden op een ultramicrotoom.
-
Voor SEM geldt een aangepaste procedure.
-
coupes worden op een preparaatdrager gebracht (microscoopglaasje of gridje) en gekleurd of gecontrasteerd met verschillende middelen.
-
Voor LM is HE-kleuring (hematoxyline/eosine=basische/zure kleurstof) de gangbare kleuring. Voor Tem worden oplossingen van zware metalen zoals lood- en uranylionen gebruikt.
-
DNA en RNA kleuren met hematoxyline donkerblauw en worden basofiel genoemd. Eiwitten kleuren lichtroze met eosine en worden acidofiel of eosinofiel genoemd.
Lichtmicroscopie
-
Helderveldmicroscopie maakt gebruik van normaal, wit licht. De aangekleurde celonderdelen in de coupe komen met deze methode naar voren. Varianten zijn donkerveld- of polarisatie-microscopie.
-
Fluorescentiemicroscopie gebruikt ultraviolet licht (met kleine golflengte) om fluorescerende moleculen in een coupe op te sporen op grond van hun emissie van licht met een langere golflengte. Hiermee kunnen natuurlijke of aangebrachte moleculen en specifieke probes worden opgespoord.
-
Fasecontrastmicroscopie is gebaseerd op de natuurlijke verschillen in de brekingsindex van cellen en weefsels. Kleuring is niet nodig, zodat levende cellen in een uitstrijkje of celkweek direct waargenomen kunnen worden.
-
Interferentiemicroscopie is vergelijkbaar met fasecontrastmicroscopie, maar vormt een reliëf-beeld.
-
Confocale microscopie scant een preparaat met een monochrome laserbundel die in een vlak in het preparaat gefocusseerd wordt. Bij de beeldvorming wordt het fluorescentielicht buiten dit vlak weggefilterd. Beelden uit opeenvolgende vlakken kunnen door een computer tot een fluorescent 3D- beeld worden samengesteld.
-
De resolutie van de lichtmicroscopie benadert 0,1 μm. Met behulp van speciale computerondersteunde technieken kan men nu onder deze grens komen met de superresolutie-microscoop.
-
De ‘atomic-force’-microscoop (AFM) is gebaseerd op een aftastende siliconen sensor, maar in het onderzoek is deze microscoop nog niet echt doorgebroken.
Elektronenmicroscopie
-
Als beeldvormend medium hebben elektronen een veel kleinere golflengte, zodat een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) een hogere resolutie geeft, tot 0,1 nm. Daarmee kan men de ultrastructuur van cellen en weefsels tot op moleculair niveau bestuderen.
-
In een transmissie-elektronenmicroscoop (Tem) vormen de elektromagnetische lenzen een elektronenbundel. Als deze bundel een ultradun preparaat doorstraalt, ontstaat een beeld doordat zware metalen van de contrastering elektronen uit de bundel ‘wegkaatsen’. Het beeld wordt weergegeven via een fluorescentiescherm of een camera.
-
vriezen en breken van bevroren cellen of weefsels maakt de studie van het gedetailleerde oppervlak mogelijk. Het oppervlaktereliëf kan nog versterkt worden door vriesetsen, eventueel gevolgd door het maken van een replica met het opdampen van zware metalen op het oppervlak in een vacuüm.
-
‘scanning’-elektronenmicroscopen (SEM) scannen het oppervlak van een preparaat met een elektronenbundel. Deze weekt uit het preparaat secundaire elektronen los, die vervolgens door een detector geregistreerd worden. Het preparaat bevindt zich in een vacuüm en is met een dun laagje goud bedekt om het geleidend te maken.
Cel- en weefselkweek
-
Door hun relatieve onafhankelijkheid kunnen cellen, nadat ze uit hun weefselverband los zijn gemaakt, in vitro gekweekt worden in een samengesteld medium. Sommige cellijnen kunnen geruime tijd verder worden gekweekt. Primaire culturen van vers geïsoleerde cellen worden meestal gedurende een beperkte tijd gebruikt. Celkweken in een petrischaal worden meestal van onderen bekeken met een ‘invert’-microscoop.
Cyto- en histochemie
-
Enzymcytochemie maakt gebruik van de rest- activiteit van een enzym na ‘zachte’ fixatie. Het aangeboden substraat wordt omgezet door het enzym, terwijl in het medium een reagens aanwezig is dat het product van het enzym zichtbaar neerslaat op de plaats van het enzym.
-
Bekende enzymen die vaak worden gedetecteerd, zijn fosfatases, dehydrogenases en peroxidases. Peroxidase kan ook als label worden gebruikt na koppeling aan een antilichaam in een immunohistochemische studie.
-
Omdat chemische fixatie en inbedding meestal de aard van enzymen, epitopen en andere specifieke moleculaire structuren vernietigt of maskeert, maakt men voor cytochemische studies vaak gebruik van vriescoupes van verse cellen of weefsels. Daarin zijn namelijk nog alle reactieve plaatsen en wateroplosbare stoffen bewaard.
-
In de immunohistochemie lokaliseert men een antigeen met behulp van een specifiek antilichaam, dat meestal gelabeld is met een fluorescerendemerker of peroxidase voor LM, of kleine gouddeeltjes voor Tem.
-
Met de directe methode lokaliseert men een anti- geen met een gelabeld primair antilichaam.
-
Bij de indirecte methode lokaliseert men een antigeen met een ongelabeld primair antilichaam, dat op zijn beurt met een secundair, gelabeld antilichaam wordt gedetecteerd. Dit is in de praktijk efficiënter, aangezien het secundaire antilichaam voor verscheidene lokalisaties gebruikt kan worden.
-
In-situhybridisatie kan worden gebruikt om specifieke sequenties in DNA of RNA te lokaliseren in cellen met behulp van specifieke, gelabelde nucleotidensequenties.
-
Er is een flink aantal specifieke reacties tussen macromoleculen bekend die gebruikt kunnen worden om een van de twee in cellen te lokaliseren. Voorbeelden: lectines reageren met suikergroepen, proteïne-A met immunoglobuline, falloïdine met F-actine.
Interpretatie en belang van microscopie
-
De procedure voor het maken van microscopische preparaten is omslachtig, tijdrovend en vraagt specifieke deskundigheid. Dat geldt ook voor het optimaal gebruik van een microscoop en het maken en interpreteren van de beelden. Daar komt nog bij dat tijdens dit proces artefacten kunnen optreden; dat wil zeggen dat structuren de novo kunnen ontstaan door het toepassen van de technieken. De interpretatie daarvan is een bijkomende complicatie.
-
coupes zijn tweedimensionale doorsneden van een 3D-structuur. Dit speelt een rol in de interpretatie van de beelden.